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一恒光照培養箱在三球懸鈴木培養中的應用

[導讀]以三球懸鈴木成熟果球為材料,研究不同消毒方式與不同無機鹽濃度對其種子萌發的影響,篩選三球懸鈴木果球離體培養的最適培養基; 以無菌幼苗葉片為外植體,探討葉齡、光照條件對愈傷組織誘導及植物生長 調節劑濃度對不定芽分化的影響,建立高效的葉片再生體系。

本實驗以三球懸鈴木成熟果球為材料,探討了不同消毒方式、無機鹽濃度對其種子萌發的影響,以及葉齡、光照對葉片愈傷組織誘導和植物生長調節劑濃度對不定芽分化的影響,初步建立三球懸鈴木果球離體培養技術及高效的葉片再生體系,以期為促進三球懸鈴木離體植株再生和苗木的推廣提供參考。



1 材料與方法

鄭州大學校園內生長健壯的6 年生三球懸鈴木的成熟果球。


1. 2 實驗方法

1. 2. 1 種子消毒

剝離果球中的種子,先用自來水沖洗1 h,再用含洗滌劑的溶液揉洗10 min,然后用自來水沖洗干凈。用無菌濾紙吸干種子表面水分后,先用75 %乙醇浸泡30 s,然后用含少量Tween-20 的10 %H2O2進行不同時間( 5 min、10 min、15 min、20 min)的消毒處理,然后將種子分別播種于EX 培養基( 與李思等的種子無菌萌發培養基成分相同) 和MS培養基中,光照培養( 光照強度1 500 Lx、光周期16 時/天、溫度25℃) 45 天后,觀察無菌苗的生長狀況,統計種子的萌發率和污染率,分析消毒時間、無機鹽濃度對無菌苗種子萌發的影響。



2 結果與分析

2. 1 三球懸鈴木果球離體培養和無菌苗的獲得

2. 1. 1 污染問題

在培養初期,因三球懸鈴木種子較小,果毛較多,種皮較厚,利用常規的消毒方法( 0. 1 %HgCl2消毒10 min 和10 %NaClO 消毒20-30 min)消毒后,萌發過程中仍污染嚴重,即使延長消毒時間,污染仍然嚴重,且由于消毒劑對種子長時間的毒害作用,導致種子萌發率低,無菌苗長勢差,生長緩慢,褐化嚴重,阻止了離體培養無菌苗在短時間內的獲得,成為系統構建三球懸鈴木再生體系的重大障礙。H2O2毒性較小,且低濃度有打破種子休眠作用。圖1 表明,使用H2O2作為消毒劑,隨著消毒時間的增加,種子污染率下降,萌發率也隨之降低,當消毒時間為10 min 時,可在不影響萌發率的前提下將污染率降到最低,且無菌苗長勢較好,組培苗無褐化現象。


3 結論與討論

選擇合適的外植體是建立再生體系的重要前提。植物不同時期、不同部位、不同來源的材料都可以作為再生體系建立的外植體。懸鈴木的再生多以當年生枝條、2-3 年生枝條、葉片和下胚軸為外植體,但當年生或2-3 年生枝條的取材易受季節限制,而下胚軸又不易大量獲得。三球懸鈴木果球成熟后,可長期保存,本實驗采用無菌苗葉片作為再生外植體,將成熟果球上剝離的種子用75 %乙醇浸泡30 s,含少量Tween-20 的10 %H2O2消毒10 min 后,播種于低鹽成分的EX 培養基上,可明顯提高其種子的萌發率,為組織再生提供大量的外植體。用10 %H2O2消毒處理時,時間過短,種子污染率大,時間過長,種子的萌發率急劇下降,因此選擇合適的消毒時間( 10 min) ,才能在保證萌發率的前提下降低污染。

恒溫光照培養(上海一恒科學儀器有限公司)的條件對葉片的脫分化有重要影響,葉片先經過7 天的黑暗培養,再轉入光照培養,愈傷組織誘導率比直接光照培養的高約30. 67 %,且愈傷組織致密、生長狀態良好,不易褐化死亡。這與劉國鋒等的研究結果強光會抑制愈傷組織的形成和生長,進而不利于芽的分化是一致的。此外,經歷黑暗培養,可以促進不定芽的分化。




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